Disertasi

Prospek Kitosan Berat Molekul Rendah Sebagai Bahan Antikanker Alami Untuk Karsinoma Sel Skuamosa Rongga Mulut: Kajian Khusus Pada Apopotosis dan Proliferasi Sel Secara In Vitro = Prospectus of Low Molecular Weight Chitosan As Natural Anticancer Agent For Oral Squamous CeJI Carcinoma: Analysis ofApoptosis And Cell Proliferation In Vitro.

Latar Belakang, Masih diperlukan penelitian untuk mendapatkan altematif bahan antikanker yang memberikan efek sitotoksik yang spesifik _pada karsinoma sel skuamosa rongga mulut (KSSRM) dengan efek minimal terhadap sel normal. Kitosan, suatu bahan biopolimer dengan berbagai manfaat telah men:perlibatkan efek antikanker terhadap beberapa jenis kanker. Namun belum t~rdapat data penelitian tentang efektifitas penggunaan kitosan pada KSSRM dan belum diketahui pula perbandingan efeknya dengan cisplatin dalam hal toksisitas bahan pada keratinosit. TUjuan, Menganalisis sifat antikanker kitosan berat molekul rendah (KBMR) dalam hal sitotoksisitas dan menganalisis efeknya terbadap kejadian apoptosis dan proliferasi sel pada galur KSSRM. Metode, Uji sitotoksisitas KBMR terhadap sel Ca9-22 yang mendapatkan nilai IC so ditetapkan berdasarkan uji 3-(4,5­ dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromide (MTT). Analisis Termina! deoxynuc!eotidyl transferase-mediated dUTP-biotin Nick End Labeling (TUNEL) dan kuantifikasi kolorimetri aktifitas caspase 3, 8 dan 9 denganJtanpa inhibitornya, dilakukan untuk mengetahui kejadian apoptosis dan jalur yang berperan setelah paparan KBMR. Analisis profil sikllus sel dengan Laser Scanning Cytometer dilakukan untuk mengetahui presentasi sel pada setiap rase siklus sel yang menggambarkan pola proliferasi sel setelah paparan KBMR. Uji eksperimental laboratorium ini juga menggunakan kultur sel HaCaT sebagai kontrol dan cisplatin sebagai baban antikanker pembanding KBMR. Hasil, Sitotoksisitas cisplatin pada sel Ca9-22 jauh lebih kuat daripada KBMR dengan nilai IC so 8±O,029/l.g!ml vs 800±131,45f.lglml, p=O,00051. NamuIl, efek sitoksik KBMR yang terjadi pada sel Ca9-22 tidak terlihat pada sel HaCaT, 53,26±5,22% vs 89,69±16,56%, p < O,Ol. Sebaliknya rerata viabilitas sel HaCaT dibanding Ca9-22 setelah paparan cisplatin secara berurutan adalah 49,O1±6,64% dan 48,94±5,52%, p > O,05. Peningkatan jumlah sel positif TUNEL setelah paparan KBMR adalab 9,O±3,6%, p < O,OI, namun jumlah ini jauh lebih rendah dari kelompok sel yang dipapar cisplatin 20,8±1,4%, p O,05 dan relatif sangat kecil dibanding peniogkatan aktifitas caspase 3 setelah paparan cisplatin. Selanjutnya, walaupun aktifitas caspase 8 lebih besar daripada aktifitas caspase 9, narnun p > O,05. Populasi sel yang berada pada fase sub G 1 seteiah paparan KBMR lebih banyak 4%, dibanding kontrol, menjadi 7±1,57%, namun p >O,05. Populasi sel Ca9-22 pada fase G 1 setelah paparan KBMR meningkat dari 34% menjadi 51 %, p < o,OOl. Populasi sel Ca9-22 pada fase S setelah paparan KBMR meningkat 8%, dari 24% menjadi 32%, p < O,OI selanjutnya paparan KBMR menyebabkan persentasi jumlah sel pada fase M turun dari 37±1,15% menjadi hanya 9±l.07%, p < O,OOOl. Pembahasan, Penelitian ini memperlihatkan bahwa walaupun dengan konsentrasi yang tinggi, KBMR sitotoksik pada galur KSSRM (sel Ca9-22), namun relatif aman untuk sel normal bukan kanker (sel HaCaT), sehingga penggunaan bahan ini mungkin dapat menurunkan efek samping kemoterapi. Apoptosis kemungkinan bukan mekanisme kematian sel utama yang terjadi akibat paparan KBMR berdasarkan data 11JNEL, aktifitas caspase dan populasi sel pada fase subG 1. Aktifitas caspase 3 yang menurun setelah pemberian caspase 8 inhibitor atau caspase 9 inhibitor kemungkinan berarti bahwa kedua caspase berperan dalarn kejadlan apoptosis pada sel Ca9-22 ioi. Namun, kareoa aktifitasnya sangat sedikit, maka kemungkinao apoptosis bukan mekanisme utama yang diaktifasi untuk mekanisme kematian sel setelah paparan KBMR pada sel Ca9­ 22. Hambatan siklus sel pada fase G1 dan S setelah paparan KBMR kemungkinan diatur oleh berbagai protein yang berperan pada siklus sel yang mengatur ched:poinl G lIS dan S. Identifikasi profil protein yang berperan pada mekanisme hambatan tersebut merupakan lahan penelitian lanjutan yang masih perlu dilakukan. Simpu)an, Kitosan berat molekul rendah mempunyai sitotoksisitas selektif terhadap sel Ca922 sehingga relatif aman untuk sel normal. Apoptosis bukan mekanisme kematin sel utama yang disebabkan oleh paparan KBMR dan jalur ekstrinsik juga bukan merupakao jalur apoptosis yang berperan pada kejadian apoptosis yang terjadi. Paparan KBMR menyebabkan hambatan proliferasi pada fase G1 dan S. Penelitian ini membuktikan bahwa KBMR mempunyai prospek yang baik untuk dapat dikembangkan sebagai bahan antikanker. Namun uji farmakodinamik KBMR ioi masih harus dilanjutkan dengan uji sitotoksisitas pada hewan coba, pengembangan formulasi obat dan akhimya uji kliois pada manusia sebelum akhimya dapat ditetapkan menjadi suatu bahan obat antikanker.
Kata kunci: kitosan, sitotoksisitas selektif, apoptosis, proliferasi, kanker mulut


Background, Research in finding alternative anticancer agent with specific cytotoxic effect on oral cancer cells and minimal effect on normal cells is still needed. Chitosan, a multipurpose biomaterial has been shown to have anticancer effects on several types of cancer. However, data on its effects on oral squamous cell carcinoma (SCC) cells and keratinocytes compared to cisplatin has not been available. Objectives, To analyze the anticancer properties of low molecular weight chitosan (LMWC) on oral SCC cell line in terms of cytotoxicity and analysis of its effect on apoptosis and cell proliferation to elucidate the possible mechanism of cell death. Methods, Cytotoxicity assay of LMWC on Ca9-22 cells was performed using 3-(4,5­ dimethylthiazol-2-yl)-2,5diphenyltetrazoliumbromide (MTT) assay to determine the IC so. Terminal deoxynuc1eotidyl transferase-mediated dUTP-biotin Nick End Labeling (TUNEL) assay and colorimetric quantification of caspase 3, 8 dan 9 activity with/without their inhibitors were performed to determine apoptotic event and pathway related to LMWC exposure. Cell cycle was profiled using Laser Scanning Cytometer to analyze the percentage of cells in each cell cycle phase in order to configure the proliferation status after LMWC exposure. This laboratory experimental also use HaCaT cell culture as control and cisplatin as reference drug for oral cancer treatment. Results, Cisplatin showed much higher cytotoxicity on Ca9-22 cell compared to LMWC with IC so 8±O.029J.1g!ml vs 800±l31.45J.1g!ml, p=O.00051. However, LMWC showed safety to HaCaT cells, 53.26±5.22% vs 89.69±16.56%, p < O.Ol. In contrast with cisplatin which also resulted in cytotoxic effect 00 HaCaT cells 49.01±6.64% dan 48.94±5.52%, p > O.05. Slight increase in TUNEL po, itive cells were noted in LMWC-exposed Ca9-22 cells, 9.0±3.6%, p < O.Ol, however the percentage was significantly lower than that of cisplatin-exposed cells, 20.8±1.4%, p < O.OOl. There was slight increase in caspase 3 activity on LMWC-exposed Ca9-22 cells compared to control 136.l1±11.63%, p >O.05, which was also relatively low compared to that of cisplatin-exposed Ca9-22 cells. Although caspase 8 activity was higher than that of caspase 9, the difference was not significant, p > O,05. Exposure of LMWC resulted in slight increase of cells in subGI phase by 4%, to 7±1.57%, p > O.05. Increased cells in G 1 from 34% to 51 %, p < O.OOI and in S phase from 24% to 32%, p < O.OI were noted., therefore causing major decreased in M phase cell population 37±1.15% to 9±l.07'1o, p < O.OOOl. Discussion, Although high concentration of LMWC was needed to become cytotoxic to cancer cell (Ca9-22 cells) in vitro, it showed safety to non-cancer cells (HaCaT cells), therefore might reduce chemotherapy side effects. Apoptosis might not the major cell death mechanism involved after LMWC exposure as shown by TUNEL, caspase activity and subG 1 cell population. Both apoptotic pathways, not only extrinsic pathway, might have the same role in the apoptotic event resulted after LMWC exposure on Ca9-22 cells. However, their very low activities compared to that ofcisplatin-exposed cells, most likely showed that apoptosis was not the major cell death mechanism related to LMWC exposure. Cell cycle arrest at Gland S phases after LMWC exposure might be regulated by a number of checkpoint proteins, which need further identification in future studies. Conclusion, Low molecular weight chitosan has selective cytotoxicity on Ca9-22 cells with relatively safer to HaCaT cells in comparison with cisplatin. Apoptosis is not the major cell death mechanism involved after exposure of LMWC as analyzed by TUNEL assay, caspases activity and cell cycle analysis (suG 1 population). Cell cycle arrest is the possible cell death mechanism involved after exposure ofLMWC. This study showed that LMWC has a good prospect to be developed as anticancer agent. However, further studies include in vivo experiments, drug formulation and finally clinical studies still have to be done.
Keywords: chitosan, selective cytotoxicity, apoptosis, proliferation, oral cancer