Tesis

Pengembangan Uji Real-time PCR Dupleks untuk Mendeteksi Bakteri dan Jamur Patogen pada Kultur Darah Pasien Anak Terduga Sepsis = Development of a Duplex Real-Time PCR Assay for the Detection of Bacterial and Fungal Pathogens in Blood Cultures from Pediatric Patients Suspected of Sepsis.

Latar Belakang: Sepsis pada anak merupakan kondisi gawat darurat yang membutuhkan diagnosis etiologi secara cepat dan akurat untuk meminimalkan morbiditas dan mortalitas. Kultur darah sebagai metode baku emas memiliki keterbatasan berupa waktu pemeriksaan lama, sensitivitas rendah, serta dipengaruhi oleh penggunaan antibiotik sebelumnya. Oleh karena itu, pengembangan metode molekuler seperti real-time PCR dupleks yang menargetkan gen 16S rRNA (bakteri) dan 28S rDNA (jamur) dinilai potensial sebagai alternatif diagnosis cepat. Metode: Penelitian ini merupakan studi eksperimental laboratorium dan kasus-kontrol yang dilakukan di UKK LMK FKUI dan RSUPN Cipto Mangunkusumo sepanjang Januari–Desember 2024. Dilakukan optimasi suhu annealing, konsentrasi primer, uji inhibitor,pengujian ambang deteksi, dan spesifisitas pasangan primer. Validasi dilakukan terhadap 100 sampel klinis kultur darah pasien anak terduga sepsis, terdiri atas 50 sampel kultur positif dan 50 kultur negatif. Hasil: Suhu optimal reaksi dupleks ditetapkan pada 61°C, dengan konsentrasi pasangan primer 300 nM dan template DNA 4 ng/ µl. Ambang deteksi real-time PCR mencapai 1,5 CFU/mL untuk bakteri, 2 CFU/mL untuk ragi, dan 20 CFU/mL untuk kapang. Seluruh sampel kultur darah yang positif maupun negatif berhasil diidentifikasi dengan benar menggunakan metode ini. Hasil uji validasi menunjukkan sensitivitas, spesifisitas, nilai prediksi positif (PPV), dan nilai prediksi negatif (NPV) sebesar 100%. Kesimpulan: Real-time PCR dupleks dengan target 16S rRNA dan 28S rDNA memiliki sensitivitas dan spesifisitas yang sangat tinggi dalam mendeteksi bakteri dan jamur pada pasien anak dengan klinis sepsis, termasuk pada kasus dengan hasil kultur darah negatif. Metode ini memiliki potensi sebagai metode diagnostik cepat untuk menegakan etiologi sepsis pada pasien anak, terutama dalam skenario kultur darah negatif atau disebabkan mikroorganisme yang tumbuh dengan lambat.
Kata Kunci: Real-time PCR duplex, 16S rRNA, 28S rDNA, Sepsis, Infeksi Aliran Darah


Background: Pediatric sepsis is a medical emergency that requires rapid and accurate etiological diagnosis to minimize morbidity and mortality. Blood culture, the gold standard method, has limitations including long turnaround time, low sensitivity, and reduced detection capability after prior antibiotic use. Therefore, the development of molecular methods such as duplex real-time PCR targeting the 16S rRNA gene (bacteria) and 28S rDNA gene (fungi) is considered a promising alternative for rapid diagnosis. Methods: This study was an experimental laboratory and case-control study conducted at the Clinical Microbiology Laboratory of the Faculty of Medicine, Universitas Indonesia (UKK LMK FKUI) and Cipto Mangunkusumo National Referral Hospital (RSUPN) from January to December 2024. The procedure included optimization of annealing temperature, primer volume, inhibitor testing, detection limit assessment, and primer pair specificity testing. Validation was performed on 100 clinical blood culture samples from pediatric patients suspected of sepsis, comprising 50 positive and 50 negative culture samples. Results: The optimal annealing temperature for the duplex PCR was established at 61°C, with a primer concentration of 300 nM and a DNA template concentration of 4 ng/ µl. The detection limits were 1.5 CFU/mL for bacteria, 2 CFU/mL for yeast, and 20 CFU/mL for molds. All blood culture samples, both positive and negative, were accurately identified using this method. Validation results showed 100% sensitivity, specificity, positive predictive value (PPV), and negative predictive value (NPV). Conclusion: The real-time duplex PCR targeting 16S rRNA and 28S rDNA exhibits exceptionally high sensitivity and specificity in detecting bacteria and fungi in pediatric patients with clinical sepsis, including cases with negative blood culture results. This method holds potential as a rapid diagnostic tool for establishing the etiology of sepsis in pediatric patients, particularly in scenarios involving negative blood cultures or infections caused by slow-growing microorganisms.
Keywords: Real-time PCR duplex, 16S rRNA, 28S rDNA, Sepsis, Bloodstream Infection