Tesis

Penentuan Serotipe Virus Dengue Dengan In House Multiplex Real Time RT-PCR Berdasarkan Gen Pre-Membran = Development of Dengue Virus Serotype Detection by Multiplex Real Time RT-PCR Based on Pre-Membrane Target Genes.

Penyakit Demam Berdarah Dengue (DBD) masih menjadi masalah kesehatan global ternasuk Indonesia dimana insidensi penyakit DBD semakin meningkat dan penyebarannya semakin meluas. Infeksi berbagai serotipe DENV dapat menyebabkan keparahan penyakit yang berbeda. DENV-2 dan DENV-3 menyebabkan manifestasi klinis lebih berat dari serotipe yang lain, sedangkan DENV-4 menunjukkan manifestasi klinis yang ringan. Tujuan penelitian ini adalah untuk menentukan serotipe DENV dengan metode multiplex rRT-PCR pada gen target pre membran (PrM) berbasis SYBR green. Penentuan serotipe ini juga dapat digunakan sebagai deteksi dini dan cepat infeksi DENV. Rancangan penelitian ini adalah eksperimental berbasis laboratorium. DENV yang digunakan merupakan supernatan virus yang diisolasi dari pasien DBD di Indonesia dan serum pasien DBD. RNA diekstraksi menggunakan kit Qiagen. Pertama dilakukan optimasi singleplex dengan tujuan mengetahui suhu annealing. Selanjutnya dilakukan optimasi multiplex dan dianalisis berdasarkan melting curve dan elektroforesis agarose. Nilai LoD, ketertiruan, dan keterulangan dilakukan dengan menggunakan metode multiplex yang sudah teroptimasi. Suhu annealing optimal didapatkan 55,5oC sedangkan konsentrasi primer 10 pmol. Melting curve masing-masing serotipe DENV-1, DENV-2, DENV-3, dan DENV-4 pada suhu 86oC, 81 oC, 80oC, 83 oC secara berurutan. Nilai LoD pada masing-masing serotipe DENV-1, DENV- 2, DENV-3, DENV-4 secara berturut-turut adalah 0,012 ng, 0,014 ng, 0,018 ng, dan 0,014 ng. Nilai ketertiruan dan keterulangan sebesar 100%. Multiplex rRT-PCR dapat digunakan untuk serotyping DENV. Penelitian lebih lanjut perlu dilakukan dengan jumlah sampel pasien yang lebih banyak sehingga dapat ditentukan nilai sensitifitas dan spesifisitas.
Kata kunci: DENV, multipleks rRT-PCR, gen pre membran, melting curve


Dengue Hemorrhagic Fever (DHF) is still a global health problem, including Indonesia, where the incidence of DHF is increasing and its spread is increasingly widespread. Infection with various DENV serotypes can lead to different disease severity. DENV-2 and DENV-3 cause more severe clinical manifestations than the other serotypes, whereas DENV-4 shows mild clinical manifestations. The aim of this study was to develop DENV serotype detection by multiplex rRT-PCR method on pre-membrane target genes (PrM) based on SYBR green. This serotype detection can also be used as an early and rapid detection of DENV infection. The research design was a laboratory-based experimental. The DENV used iwn this study was a virus supernatant isolated from DHF patients in Indonesia and patient’s sera. RNA was extracted using the Qiagen kit. First, singleplex was performed to obtain optimal annealing temperature. Furthermore, multiplex optimization was carried out and analyzed based on the melting curve and agarose electrophoresis. LoD values, reproducibility, and repeatability are performed using the optimized multiplex method. The optimum annealing temperature was 55.5 oC, while the primary concentration was 10 pmol. Melting curves of each serotype DENV-1, DENV-2, DENV-3, and DENV-4 at 86oC, 81 oC, 80oC, 83 oC respectively. The LoD values for each of the DENV-1, DENV-2, DENV-3, DENV-4 serotypes were 0.012 ng, 0.014 ng, 0.018 ng, and 0.014 ng, respectively. The value of reproducibility and repeatability was 100%. Multiplex rRT-PCR can be used for DENV serotyping. Further studies need to be done with a larger number of patient samples so that the sensitivity and specificity values can be determined.
Keywords: DENV, multiplex rRT-PCR, pre membrane gene, melting curve