Tesis

Pengembangan Uji Viral Load SARS-CoV-2 menggunakan Standar RNA Hasil Transkripsi In Vitro Gen Nukleokapsid = Development of Viral Load Assay using Standard RNA from In vitro Transcription of SARS-CoV-2 Nucleocapsid Gene.

COVID-19 yang disebabkan oleh infeksi Severe acute respiratory syndrome Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) merupakan wabah infeksi yang menjadi perhatian seluruh dunia karena hingga saat ini sudah lebih dari 216 juta kasus terkonfirmasi positif COVID-19. Gold standar dalam pemeriksaan COVID-19 adalah deteksi berbasis asam nukleat menggunakan real-time RT-PCR. Di Indonesia sendiri, pemeriksaan yang banyak digunakan adalah semi kuantitatif qRT-PCR. Pemeriksaan kuantitatif secara absolut diperlukan untuk mengetahui viral load dalam tubuh pasien dan diharapkan dapat digunakan untuk studi patogenesis, evaluasi uji efikasi obat antivirus dan vaksin SARS-CoV-2. Penelitian ini bertujuan untuk mengembangkan pengujian viral load menggunakan RNA hasil transkripsi in vitro sebagai standar dengan menargetkan gen nukleokapsid SARS- CoV-2. Primer dan probe N1, N2 dan RP dirancang menggunakan website online dan divalidasi secara in siliko. Sebanyak 10 µg/µl-0,2 ng/µl produk PCR yang mengandung sekuens T7 promoter digunakan sebagai template untuk transkripsi in vitro. Proses transkripsi in vitro menggunakan kit T7 RiboMAX™ Express Large Scale RNA Production System untuk menghasilkan RNA. Kurva standar dibentuk dari pengenceran standar RNA dan kemudian digunakan untuk uji viral load pada 36 sampel pasien terkonfirmasi positif COVID-19 dan 8 sampel terkonfirmasi negatif COVID-19. Dengan teknik ini, kami mendapat sensitivitas dan spesifisitas primer yang tinggi. Menggunakan duplex qRT-PCR, viral load dapat dilakukan menggunakan primer RP dan N2 dengan kisaran 1000 hingga < 10 jumlah salinan/µl. LOD (Limit of detection) standar RNA N2 cukup rendah yaitu 6,5 jumlah salinan/µl. CDC mengonfirmasi keberhasilan deteksi SARS-CoV-2 apabila gen virus dan gen internal kontrol dapat terdeteksi. Faktor yang mempengaruhi LOD antara lain target gen, protokol pengujian yang digunakan dan tipe spesimen. Standar RNA hasil transkripsi in vitro dari penelitian ini dapat diaplikasikan untuk pengujian viral load pada sampel klinis.
Kata Kunci : SARS-CoV-2, Viral Load, Transkripsi In Vitro


COVID-19 caused by Severe acute respiratory syndrome Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) infection is an infectious epidemic that is of concern worldwide because more than 216 millions positive confirmed cases of COVID-19 have been reported. The gold standard in COVID-19 testing is nucleic acid-based detection using real-time RT-PCR. In Indonesia, the most widely used test is the semi- quantitative qRT-PCR. An absolute quantitative examination is needed to pathogenesis studies, evaluation of efficacy tests of antiviral drugs and SARS-CoV- 2 vaccines. This study aims to develop viral load assay targeting the SARS-CoV-2 nucleocapsid gene using in vitro transcript RNA standard. Primers and probes N1, N2 and RP were designed using an online website and validated in silico. 10 µg/µl- 0.2 ng/µl PCR product containing the T7 promoter sequence was used as a template for in vitro transcription. The in vitro transcription process used the T7 RiboMAX™ Express Large Scale RNA Production System kit to produce RNA. Standard curves were constructed from standard dilutions of RNA and then used for viral load assays on 36 samples of patients with confirmed COVID-19 and 8 samples confirmed negative for COVID-19. With this technique, we obtained high primer sensitivity and specificity. Using duplex qRT-PCR, viral loads can be determined using RP and N2 primers in the range of 1000 to < 10 copies/µl. The standard LOD of RNA N2 is quite low at 6.5 copy number/µl. The CDC confirms the successful detection of SARS-CoV-2 if both viral genes and internal control genes can be detected. Factors that affect LOD include the target gene, the testing protocol used and the type of specimen. The standard in vitro transcription of RNA from this study can be applied for viral load testing in clinical samples.
Keywords: SARS-CoV-2, Viral Load, In vitro Transcription