Tesis

Optimasi Uji Duplex Real-time PCR untuk Deteksi Corynebacterium diphtheriae Potensial Toksigenik dan Penerapan pada Spesimen Usap Tenggorok Pasien Tersangka Difteri = Optimization of Duplex Real-time PCR Assay for Detection of Potentially Toxigenic Corynebacterium diphtheriae and Application Using Throat Swab of Suspected Diphtheria Patient.

Latar belakang: Difteri merupakan penyakit infeksi bakteri yang diperantarai oleh toksin. Corynebacterium diphtheriae adalah penyebab tersering difteri. Diagnostik laboratorium harus dilakukan dengan cepat untuk menunjang diagnosis klinis difteri. Pemeriksaan mikroskopik tidak direkomendasikan karena tidak spesifik, kultur dan uji toksin yang merupakan uji baku emas cukup memakan waktu, membutuhkan keterampilan dan pengalaman serta hanya dilakukan di laboratorium rujukan. PCR merupakan metode pemeriksaan yang cepat, sensitif dan spesifik. Duplex real-time PCR dapat mendeteksi bakteri penyebab tersering dan gen pengkode toksin secara simultan. Tujuan penelitian: Melakukan optimasi uji duplex real time PCR untuk deteksi C. diphtheriae potensial toksigenik dan menerapkannya pada spesimen usap tenggorok pasien tersangka difteri. Metode: Duplex real-time PCR menggunakan dua pasang primer dan probe dengan target gen rpoB C.diphtheriae dan toksin difteri subunit A Tox. Parameter yang dioptimasi adalah suhu penempelan, konsentrasi masing-masing primer dan probe, inhibitor, reaksi silang dengan patogen lain dan ambang batas deteksi uji. Kemudian uji diaplikasikan pada spesimen usap tenggorok pasien tersangka difteri yang dirawat di RSPI Sulianti Saroso pada periode 2018-2019. Sebagai perbandingan dilakukan uji Elek untuk konfirmasi toksigenitas dan analisa data klinis pasien. Hasil: Kondisi optimal uji didapat pada suhu penempelan 55 o C, konsentrasi primer Cd 0,4 µM, primer Tox 0,6 µM, probe Cd 0,5 µM dan probe Tox 0,625 µM, volume elusi ekstraksi DNA 50 µL, volume cetakan DNA 5 µL dan ambang batas deteksi 2 CFU/ml. Uji tidak bereaksi silang dengan mikroorganisme lain yang dicobakan. Dari 89 sampel, proporsi positif C.diphtheriae potensial toksigenik dengan uji duplex real-time PCR adalah 21,3%, sedangkan proporsi positif C.diphtheriae toksigenik menggunakan uji baku emas adalah 11,2%. Kesimpulan: Duplex real time PCR untuk deteksi C.diphtheriae potensial toksigenik telah dioptimasi dan diaplikasikan pada pasien tersangka difteri. Diharapkan uji ini dapat meningkatkan diagnosis laboratorium kasus difteri.
Kata kunci: C.diphtheriae, Tox, Duplex real-time PCR


Background: Diphtheria is toxin-mediated bacterial infection. The most common etiology is Corynebacterium diphtheriae. Laboratory diagnostic should be done immediately to support clinical diagnosis. Microscopic examination is not recommended, culture followed by toxin test is consider gold standard but timeconsuming, require experience and only done in referral laboratory. PCR is fast, sensitive and specific. Duplex real-time PCR can detect bacteria and toxin-encoding gene simultaneously. Objective: Optimizing duplex real-time PCR assay for detection of potentially toxigenic C.diphtheriae and applicate the assay on throat swab of suspected diphtheria patient. Method: Two pair of primers and specific probe targeting rpoB gene of C.diphtheriae and A-subunit of diphtheria toxin gene were used in this study. Parameters including annealling temperature, concentration of primers and probes, inhibitors, cross reaction and detection limit were being optimized to receive optimal condition. The optimized assay was applicated on throat swab of suspected diphtheria patient in Sulianti Saroso Infectious Disease Hospital at 2018-2019. Elek toxigenity test was used for comparison and clinical data of the patient were analyzed. Result: The optimum condition for duplex real-time PCR was received upon the annealing temperature 60 o C, concentration of Cd primer 0,4 µM, Tox primer 0,6 µM, Cd probe 0,5 µM, Tox probe 0,625 µM, DNA elution volume 50 µL, DNA template volume 5 µL and detection limit 2 CFU/ml. There was no cross reaction found with other tested microorganisms. Of 89 samples, proportion of potentially toxigenic C.diphtheriae was 21,3% and proportion of toxigenic C.diphtheriae confirmed by gold standard was 11,2%. Conclusion: Duplex real time PCR has been optimized for detection of potentially toxigenic C.diphtheriae. This method can be used to detect C.diphtheriae and Tox simultaneosly and increase supporting diagnosis.
Keywords: C.diphtheriae, Tox, Duplex real-time PCR