Tesis

Eksplorasi enzim pereduksi sitoglobin dari ekstrak hati sapi = Exploration of cytoglobin reducing enzymes from bovine liver extract.

Latar Belakang: Pada penelitian terdahulu telah dibuktikan bahwa sitoglobin (Cygb) mampu mengikat beberapa jenis gas dengan pola spektrum yang khas. Di sisi lain juga ditemukan bahwa Cygb yang teroksidasi dapat direduksi oleh homogenate supernatant sel hati sapi yang dibuktikan dengan kurva kenaikan produk Cygb-Fe 2+ dari Cygb-Fe 3+ . Berdasarkan penemuan tersebut kami menduga adanya sejenis protein yang mampu mereduksi Cygb-Fe 3+ menjadi Cygb-Fe 2+ yang fungsinya analog dengan diaphorase pada metHb dan cytochrome b5 reductase 3 (CYB5R3) pada metMb.
Metode: Cygb diisolasi dengan teknik fraksinasi 90% jenuh, selanjutnya dipurifikasi dengan kromatografi penukar ion (DEAE Selulosa) dan kromatografi imunoafinitas. Enzim reduktase diisolasi menggunakan larutan RIPA lysis buffer dan dipurifikasi dengan kromatografi Affi gel blue yang dikonfirmasi dengan SDSPAGE dan Western blot. Activitas enzim reduktase yang diperoleh dilihat dari rasio antara serapan maksimum Cygb-Fe 3+ (metCygb) dan Cygb-Fe 2+ (deoksiCygb).
Hasil: Isolasi dan purifikasi menggunakan DEAE selulosa menghasilkan puncak kedua yang mengandung protein bermuatan negatif sesuai dengan karakteristik dari protein Cygb. Purifikasi dengan kromatografi imunoafinitas menggunakan antibodi anti-Cygb, diperlihatkan pada puncak kedua yang berikatan secara spesifik ke antibodi anti-Cygb. Enzim reduktase dari lisat sel yang diekstrak menggunakan RIPA lysis buffer dipurifikasi menggunakan kromatografi Affi gel blue yang diperoleh pada puncak A dan diduga sebagai CYB5R3. Hasil tersebut dikonfirmasi dengan Western blot yang mampu mereduksi Cygb-Fe 3+ menjadi Cygb-Fe 2+ dan menunjukkan karakteristik yang sama dengan lisat sel yang tidak dimurnikan. Lisat sel yang tidak dimurnikan menunjukkan kemampuan yang lebih baik dalam mereduksi Cygb-Fe 3+ menjadi Cygb-Fe 2+ dibandingkan eluat puncak A kromatografi Affi gel blue. Analisis berat molekul dengan SDS-PAGE menghasilkan satu pita yaitu ~60 kDa pada eluat puncak A dan lisat sel hati sapi yang tidak dimurnikan, sementara CYB5R3 menghasilkan satu pita pada ~34 kDa. Cygb-Fe 3+ tidak dapat direduksi oleh diaphorase.
Kesimpulan: Kami menyimpulkan terdapat enzim reduktase yang dapat mereduksi Cygb-Fe 3+ menjadi Cygb-Fe 2+ di dalam lisat sel hati sapi dan eluat puncak A kromatografi Affi gel blue, tapi enzim tersebut bukan merupakan diaphorase maupun CYB5R3.
Kata kunci: enzim reduktase, sitoglobin, purifikasi, kromatografi


Background: In previous studies it has been proven that cytoglobin (Cygb) is able to bind several types of gases with a typical spectrum pattern. On the other hand it was also found that oxidized Cygb can be reduced by supernatant of bovine liver cell homogenate as proven by increased production of Cygb-Fe 2+ from Cygb-Fe 3+ . Based on these findings we suspected that in bovine liver tissue, there is a protein act as a reductase which is analogous to diaphorase in metHb and cytochrome b5 reductase 3 (CYB5R3) in metMb.
Method: Cygb was isolated by 90% saturation of ammonium sulfate fractionation, then purified by ion exchange chromatography (DEAE-cellulose) and immunoafinity chromatography. The suspect reductase enzyme in bovine liver homogenate was isolated using RIPA lysis buffer and purified by Affi gel blue chromatography confirmed by SDS-PAGE and Western blot. The activity of suspect reductase enzyme is determined by the ratio of maximum absorbance between Cygb-Fe 3+ (metCygb) and Cygb-Fe 2+ (deoxyCygb).
Result: Isolation and purification using DEAE-cellulose result the second peak with negative charge protein characteristic like the Cygb protein. Purification with immunoaffiniy chromatography using anti-Cygb antibody, showed the second peak which bind specifically to antibody anti-Cygb. The suspect reductase from lysate cell with RIPA buffer was purified using Affi gel blue chromatography showed the peak A is suspected as CYB5R3. It was confirmed by Western blot, which was able to reduce Cygb-Fe 3+ to Cygb-Fe 2+ and showed the same characteristic with the unpurified bovine liver cell lysates. Unpurified bovine liver cells lysate showed a better capability in reducing Cygb-Fe 3+ to Cygb-Fe 2+ than peak A of Affi gel blue chromatography eluate. Molecular weight analysis with SDS-PAGE showed a band with ~60 kDa in peak A and unpurified bovine liver cell lysate, while CYB5R3 showed a band with 34 kDa. Cygb-Fe 3+ cannot be reduce by the diaphorase.
Conclusion: We concluded that there is a reductase enzyme which can reduce Cygb-Fe 3+ to Cygb-Fe 2+ in the unpurified bovine liver cell lysate and peak A of Affi blue gel chromatography, but it is not a diaphorase nor CYB5R3.
Keywords: reductase enzyme, cytoglobin, purification, chromatography