Disertasi

Profil ekspresi gen kepuncaan pada kanker payudara stadium lanjut setelah terapi neoajuvan dihubungkan dengan jalur pensinyalan apoptosis, stres oksidatif dan hipoksia. = Stemness gene expression profile in advanced breast cancer after neoadjuvant therapy correlated with apoptotic, oxidative stress and hypoxia signaling pathways.

Latar Belakang: Sekitar 30%-50% pasien kanker payudara yang didiagnosis pada stadium dini cenderung mengalami kekambuhan dan berkembang ke arah metastasis meskipun telah mendapatkan terapi. Keberadaan sel punca kanker payudara diduga berkontribusi dalam timbulnya resistensi terapi. Beberapa mekanisme yang mempengaruhi respons terapi pada kanker yaitu aktifnya jalur sinyal embrionik, hambatan apoptosis dan tingginya perbaikan DNA serta adaptasi sel punca kanker terhadap hipoksia dan stres oksidatif. Tujuan: Menganalisis profil ekspresi gen kepuncaan pada kanker payudara setelah terapi neoajuvan hormonal dan kemoterapi dilihat hubungannya dengan jalur apoptosis p53, jalur stres oksidatif NFkB dan penanda hipoksia HIF-α serta respons terapi. Metode: Penelitian ini terdiri dari eksperimen in vivo dan in vitro. Pada eksperimen in vivo digunakan sampel jaringan kanker payudara stadium IIIB dan IV sebelum terapi neoajuvan (46 sampel pre) dan setelah terapi neoajuvan (46 sampel post). Total RNA diekstraksi kemudian dilakukan pengukuran ekspresi dengan menggunakan teknik Next Generation Sequencing (Truseq® targeted RNA expression Illumina) dengan menggunakan panel sel punca, p53 dan NFkB. Selain itu juga ekspresi HIF-1α dan HIF-2α diukur dengan menggunakan qRT-PCR. Pada eksperimen in vitro digunakan kultur primer sel punca kanker payudara ALDH+ yang diberikan doksorubisin 0,25 μM atau endoksifen 4μM selama 14 hari, dengan penggantian medium tiap 2 hari. Viabilitas sel dihitung dengan menggunakan metode trypan blue exclusion serta ekspresi gen kepuncaan (ALDH1A1, HDAC2), jalur p53 (BIRC5, PCNA) dan jalur NFkB (SOD2, STAT1) diukur dengan menggunakan qRT-PCR. Hasil: Setelah terapi neoajuvan, profil ekspresi gen kanker payudara yang memiliki respons molekuler yang baik pada jalur kepuncaan adalah CCNE1, CDC42, CTNNB1, HDAC2, PSEN1, PSENEN, pada jalur apoptosis adalah BIRC5, CASP8, CASP9, CDK1 dan PCNA, pada jalur stres oksidatif adalah SOD2, STAT1 dan TBK1, serta pada jalur hipoksia yaitu HIF1α dan HIF-2α. Profil ekspresi gen dengan respons molekuler yang buruk pada jalur kepuncaan adalah ALDH1A1, ALDH2, CCND2, CXCL12, FZD7, IGF1, sedangkan pada jalur apoptosis adalah ATM dan BID. Ekspresi gen kepuncaan ALDH1A1, CCND2 dan CXCL12 setelah terapi neoajuvan mengalami peningkatan bermakna pada sampel kanker payudara dengan respons molekuler yang baik untuk ekspresi gen jalur apoptosis, namun tidak memiliki perbedaan bermakna pada sampel dengan ekspresi gen stres oksidatif dan hipoksia respons molekuler baik. Respons histopatologis (Miller Payne) berkorelasi positif bermakna dengan ekspresi gen jalur apoptosis dengan respons molekuler yang baik (BIRC5, CASP8, CDK1), namun berkorelasi negatif bermakna dengan ekspresi gen ALDH1A1. Survival pasien kanker payudara berkorelasi negatif bermakna dengan ekspresi ALDH1A1 dan SOD2. Ekspresi gen ALDH1A1 dan SOD2 juga terbukti berperan dalam penurunan sensitivitas doksorubisin secara in vitro pada sel punca kanker payudara. Kesimpulan: Ekspresi gen ALDH1A1 dan SOD2 merupakan faktor penting untuk prediksi prognosis terapi neoajuvan sistemik pada pasien kanker payudara stadium lanjut.
Kata Kunci: sel punca kanker payudara, ALDH1A1, SOD2, terapi neoajuvan.


Introduction: Approximately 30% -50% of breast cancer patients diagnosed at an early stage tend to relaps and progress to metastasis although received therapy. The presence of breast cancer stem cells is considered to contribute to therapeutic resistance. There are some mechanisms affected therapy response in the cancer, such as active embryonic signaling pathways, inhibition of apoptosis and high DNA repair, adaptation to hypoxia and oxidative stess. Aim: to analyse the stemness gene expression profile in breast cancer after neoadjuvant chemotherapy and hormonal therapy correlated with apoptotic (p53), oxidative stress (NFkB) and hypoxia (HIF-α) signaling pathways and also therapeutic responses. Methods: This study consisted of in vivo and in vitro experiments. We used breast tissue samples IIIB and IV before neoadjuvant therapy (46 pre samples) and after neoadjuvant therapy (46 post samples). Total RNA was measured the expression profile using Next Generation Sequencing (Truseq® targeted RNA expression Illumina) with stem cell, p53 and NFkB panels. In addition, HIF-1α and HIF-2α expression were measured using qRT-PCR. For the in vitro experiments, we used primary cultures of breast cancer stem cells ALDH+ that treated by 0.25 μM doxorubicin or 4 μM endoxifen for 14 days, the medium replacement every 2 days. Cell viability was calculated using trypan blue exclusion method and the the expression of stem cells (ALDH1A1, HDAC2), p53 (BIRC5, PCNA) and NFkB (SOD2, STAT1) pathways were measured using qRT-PCR. Results: After neoadjuvant therapy, the expression profiles of breast cancer genes that have good molecular responses in stem cells pathway are CCNE1, CDC42, CTNNB1, HDAC2, PSEN1, PSENEN, in apoptotic pathway are BIRC5, CASP8, CASP9, CDK1 and PCNA, in oxidative stress pathway are SOD2, STAT1 and TBK1, as well as in the hypoxic pathway HIF1α and HIF-2α. Expression profiles with poor molecular responses in stem cells pathway are ALDH1A1, ALDH2, CCND2, CXCL12, FZD7, IGF1, while in apoptotic pathway are ATM and BID. Gene expression of ALDH1A1, CCND2 and CXCL12 after neoadjuvant therapy increased significantly in breast cancer samples with good molecular response in apoptotic pathway genes expression, but not have significant differences in samples with good molecular response in oxidative stress and hypoxia gene expression pathways. Histopathologic response (Miller Payne) was significantly positively correlated with apoptotic pathway gene expression with good molecular response (BIRC5, CASP8, CDK1), but negatively significant correlated with ALDH1A1 gene expression. Survival of breast cancer patients significantly negatively correlated with ALDH1A1 and SOD2 expression. Gene expression of ALDH1A1 and SOD2 has also been shown to play a role in reducing the sensitivity of doxorubicin in vitro to breast cancer stem cells. Conclusion: ALDH1A1 and SOD2 gene expression is an important factor for predicting the prognosis of systemic neoajuvan therapy in patients with advanced breast cancer.
Key Word: Breast cancer stem cells, ALDH1A1, SOD2, neoadjuvant therapy.