Tesis

Pengembangan Uji Molekuler untuk Deteksi Mutasi Gen folP, rpoB, dan gyrA Mycobacterium leprae Resisten terhadap Dapson, Rifampisin, dan Ofloksasin di Laboratorium Mikrobiologi Klinik Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia-Rumah Sakit Umum Pusat Nasional Dr. Cipto Mangunkusumo = Molecular Assay Development for Detection of folP, rpoB, and gyrA Mutation of Mycobacterium leprae Resistance to Dapsone, Rifampicin, and Ofloxacin in Clinical Microbiology Laboratory of Medicine Faculty of Universitas Indonesia-Dr. Cipto Mangunkusumo General Hospital .

Latar Belakang : Kusta merupakan penyakit infeksi kronik yang disebabkan oleh Mycobacterium leprae dan masih menjadi masalah kesehatan di dunia. Terapi penyakit kusta dipersulit dengan munculnya M.leprae yang resisten terhadap obat kusta (dapson [folP], rifampisin [rpoB], and ofloksasin [gyrA]), meskipun dengan adanya perkembangan antibiotik. Oleh karena itu, penting untuk mengembangkan uji molekuler yang dapat mendeteksi galur M.leprae resisten agar penatalaksanaan penyakit kusta menjadi lebih baik. Tujuan : Mendapatkan sistem uji genotipik untuk mendeteksi mutasi gen folP, rpoB, dan gyrA M.leprae yang menyebabkan resisten terhadap dapson, rifampisin, dan ofloksasin. Metode : Real time PCR dilakukan sebagai persyaratan analisis uji genotipik. DNA bakteri diekstraksi dengan QIAmp DNA Mini Kit. Primer nested PCR dan DNA sekuensing dirancang dengan Primer Designer software. Kondisi reaksi PCR yang dioptimasi yaitu suhu penempelan primer, volume cetakan DNA, dan jumlah siklus amplifikasi. Primer pada DNA sekuensing dianalisis untuk menentukan kualitas grafik elektroferogram. Hasil optimasi kemudian diterapkan pada spesimen kerokan jaringan kulit. Nested PCR dan DNA sekuensing yang telah dioptimasi kemudian diterapkan pada 22 spesimen kerokan jaringan kulit pasien kusta. Hasil : Uji genotipik yang dikembangkan di penelitian ini dapat diterapkan pada spesimen kerokan jaringan kulit dengan nilai Ct real time PCR kurang dari 30. Sejumlah 750 µl spesimen kerokan jaringan kulit diekstraksi dengan volume elusi akhir yaitu 60 µl. Suhu penempelan primer, volume cetakan DNA, dan jumlah siklus amplifikasi yang optimal yaitu 56°C (PCR I dan II), 15 µl cetakan DNA dalam volume reaksi 50 µl (PCR I) dan 2 µl cetakan DNA dalam volume reaksi 40 µl (PCR II), dan jumlah siklus amplifikasi PCR 40 (PCR I) dan 35 (PCR II). Uji yang dioptimasi dapat menunjukkan genotipik 17 M.leprae dengan hasil 100% sensitif terhadap dapson dan rifampisin dan 5,9% resisten ofloksasin. Kesimpulan : Uji genotipik pada penelitian ini dapat digunakan untuk mendeteksi resisten obat kusta (dapson, rifampisin, dan ofloksasin) pada pasien yang tidak mengalami perbaikan setelah mendapatkan terapi.
Kata Kunci : Uji genotipik; Resistensi obat; Mycobacterium leprae


Background : Leprosy is a chronic infectious disease caused by Mycobacterium leprae. Leprosy is still considered as health problem in the world. Even though with advanced antibiotic drugs, the treatment of leprosy tends to complicated because of emergences of M. leprae strains resistant to three drugs (dapsone [folP], rifampicin [rpoB], and ofloxacin [gyrA]). Therefore, it is important to develop a molecular assay that can detect the resistant M.leprae strains for better management of this disease. Objective : The aim of this study is to obtain a genotyping assay for detection of mutated genes of folP, rpoB, and gyrA of M.leprae that lead to resistances for dapsone, rifampicin, and ofloxacin, respectively. Methods: Real time PCR was performed for specimen requirement for genotyping analysis. Bacterial genomic DNA was extracted by QIAmp DNA Mini Kit. Primers for nested PCR and DNA sequencing were designed by Primer Designer software and the reaction condition of PCR was optimized including temperature annealing of primers, volume of DNA template, and number of thermal cycle. Primers for DNA sequencing were analyzed by means of determining qualities of electropherogram charts. The optimized nested PCR and DNA sequencing were applied for skin scrapings from 22 leprosy patients. Results: The genotyping assay developed in this study was applicable for skin scrap samples with real time PCR result of Ct less than 30. A total of 750 µl skin scraping samples were extracted with 60 µl final elution. The optimal temperature annealing of primers, volume of DNA template, and number of thermal cycle were 56°C (PCR I and II), 15 µl DNA template in 50 µl reaction (PCR I) and 2 µl DNA template in 40 µl reaction (PCR II), and 40 (PCR I) and 35 (PCR II) thermal cycles, respectively. The optimized assay could genotype 17 M.leprae strains with 100% sensitive for dapsone and rifampicin and 5,9% resistant for ofloxacin. Conclusion: The genotyping assay developed in this study can be used to detect leprosy drug resistances (dapsone, rifampicin, dan ofloxacin) particularly for patients with relapse or no significant improvement clinically.
Keywords: Genotyping assay, Drug resistances, Mycobacterium leprae