Skripsi

Analysis of Recombinant VP22-OCT4 Fusion Protein Subcellular Location in HepG2 Cell Culture = Analisis Fusi Protein Rekombinan VP22-OCT4 pada Lokasi Subselular di Kultur Sel HepG2.

Background: Currently, there are many studies ongoing about pluripotent stem cell and its remarkable potential to become the future regenerative therapy. Until now, embryonic stem cell is the only source that has been studied well for pluripotent stem cell. However, there are many constraints regarding this matter due to some ethical problems in obtaining the blastocyst from embryo and risk of cell transplantation rejection of the immune system. Recently, there are many studies undergone in exploring new approach through reprogramming somatic cell to become induced pluripotent stem cell (iPSC). iPSC could be utilized in many applications for future medicine like as a cell replacement therapy, studying diseases and as for screening and developing new drugs. OCT4 (Octamer-binding transcription factor 4) is one of the crucial proteins that is responsible for the selfrenewal of embryonic stem cell. Therefore, a research should be carried out in investigating the ability of OCT4 transcription factor, with the help a vehicle protein named VP22 (viral protein), to be localized into adult somatic cells, particularly HepG2 cell used for this research, which in turn could reprogram HepG2 cell into iPSC. Purpose: The aim of this study is to investigate the ability of recombinant fusion protein of VP22-OCT4 to be localized into the intranuclear region of HepG2 cell. Methods: For the experimental groups, HepG2 cells are isolated with VP22OCT4 recombinant fusion protein for 1 hour and 6 hours, which then followed by isolating with mouse monoclonal IgG primary antibody against OCT4 (Ab1) and goat anti-mouse IgG secondary antibody, FITC conjugate (Ab2) respectively for the indirect immunofluorescence staining function. For the control groups, HepG2 cells are only isolated with the mouse monoclonal IgG primary antibody (Ab1) and followed by goat anti-mouse IgG secondary antibody, FITC conjugate (Ab2) for 1 hour and 6 hours. Confocal microscope is utilized afterwards to observe the presence of immunofluorescence of the four groups. 10 microscopic fields will be observed for each group and the data that is recorded is the percentage of immunofluoresced cells in each field to determine whether VP22-OCT4 recombinant protein could be localized to HepG2 cells or not. Result: There is a significant difference between the control groups and the experimental groups for both incubation period (p = 0.005 for 1 hour and p = 0.000 for 6 hours). Moreover, there is also a significance difference between the group of HepG2 cells with VP22-OCT4 incubated for 1 hour and 6 hours (p = 0.044).
Key words: VP22, OCT4, Recombinant Fusion Protein, HepG2 Cells


Latar belakang: Saat ini terdapat banyak sekali studi yang sedang berjalan tentang sel punca pluripoten dan potensinya untuk menjadi terapi regeneratif pada masa yang akan datang. Sampai sekarang, sel punca embrionik adalah satusatunya sumber untuk sel punca pluripoten yang telah dipelajari dengan baik. Akan tetapi, banyak sekali tantangan untuk memakai sel punca embrionik ini sebagai terapi medis dikarenakan masalah etik menggunakan embrio yang masih hidup sebagai pengobatan dan juga masalah penolakan sistem imun tubuh terhadap transplantasi sel. Belakangan ini, banyak sekali studi yang sedang berjalan dalam menginvestigasi cara baru dalam pemograman ulang (reprogramming) sel manusia untuk menjadi induced pluripotent stem cell (iPSC). iPSC dapat digunakan dalam berbagai aplikasi medis pada masa yang akan datang seperti terapi penggantian sel (cell replacement therapy), mempelajari penyakit dan merancang obat baru. OCT4 (Octamer-binding faktor transkripsi 4) adalah salah satu protein krusial yang bertanggung jawab atas pembaharuan (selfrenewal) sel punca embrionik. Maka dari itu, sebuah penelitian harus dilakukan untuk mencari tahu kemampuan faktor transkripsi OCT4 untuk dilokalisasi ke dalam sel manusia dewasa yakni sel HepG2 yang digunakan dalam riset ini dengan bantuan protein VP22 (viral protein), yang akhirnya diharapkan dapat membuat pemograman ulang sel HepG2 menjadi iPSC. Tujuan: Untuk menginvestigasi kemampuan fusi protein rekombinan VP22OCT4 untuk dapat dilokalisasi ke kompartemen intranuclear dari sel HepG2. Metode: Terdapat empat kelompok sel HepG2 dalam studi eksperimental ini, yakni 2 kelompok eksperimen dimana sel HepG2 diinkubasi dengan protein fusi rekombinan VP22-OCT4 selama 1 jam dan 6 jam, dan 2 kelompok kontrol dimana sel HepG2 diinkubasi tanpa protein fusi rekombinan VP22-OCT4 selama 1 jam dan 6 jam. Kemudian, proses indirect immunofluorescence staining dilaksanakan terhadap keempat kelompok yang mencakup inkubasi dengan mouse monoklonal IgG antibodi primer terhadap OCT4 (Ab1) dan dilanjutkan dengan goat anti-mouse IgG antibodi sekunder, FITC konjugat (Ab2). Pengamatan dengan mikroskop confocal dilaksanakan untuk melihat adanya imunofluoresen dari empat kelompok. 10 lapang pandang mikroskopis akan diamati untuk setiap kelompok dan data yang dicatat adalah persentase sel yang memberikan immunofluoresce di setiap pandangan. Hasil: Terdapat perbedaan yang bermakna antara kelompok kontrol dan kelompok eksperimen untuk kedua periode inkubasi (p = 0.005 untuk 1 jam dan p = 0,000 untuk 6 jam), serta perbedaan bermakna juga terjadi antara kelompok sel HepG2 dengan VP22 - OCT4 diinkubasi selama 1 jam dan 6 jam (p = 0,044).
Kata kunci: VP22, OCT4, Fusi Protein Rekombinan, Sel HepG2