Skripsi

MgCL2 concentration and annealing temperature optimization of RT-PCR using M primers for the detection of influenza A virus

Influenza has seriously affected worldwide as it attacks millions of people each year. The clinical manifestations of this viral infection in humans are extensively ranged from mild to severe symptoms. To accurately detect the influenza viruses, a rapid and sensitive molecular diagnostic test is generated. This research aims to develop a molecular test for the diagnosis of type A influenza virus using the reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR). The M protein of the Influenza virus differentiates influenza types, for that reason using a specific M protein can differentiate Influenza A virus from the other types. In this experimental study, its specific target is to find the optimum temperature condition for the M protein to be amplified, with or without the addition of MgCl2 . The molecular detection experiment was done using MAF 26-MAR 500 and MAF 306-MAR 744 primers, which target the M genetic fragment. Using the RT-PCR, both of the primer pairs were bound at different annealing temperature settings (54.2°C, 55°C, 56°C, 57.2°C, and 58.2°) and were undergone electrophoresis. Completed in a suitable condition, the electrophoresis gel gives the brightest band at the best suitable temperature. The target band of MAF 26-MAR 500 was visible in 54.2°C setting, as bright as the samples in 55°C, 56°C, 57.2°C, and 58.2° settings while the MAF 306-MAR744 targeted band was brightest at 56°C with the addition of MgCl2 . These results suggest their optimum condition required for them to be replicated.
Keywords: Influenza A Virus, RT-PCR, M Protein.



Influenza memiliki dampak serius di seluruh dunia dan telah mempengaruhi jutaan orang setiap tahunnya. Manifestasi klinis dari infeksi virus pada manusia berkisar dari gejala yang tergolong ringan sampai parah. Untuk mendeteksi virus influenza secara akurat, dibutuhkan tes yang sensitif. Teknik diagnostik molekulerpun dipilih karena sensitivitas dan spesifisitasnya. Penelitian ini bertujuan untuk mengembangkan tes molekuler untuk diagnosis virus influenza tipe A dengan menggunakan reaksi berantai polimerase reverse transcriptase (RT-PCR). Protein M dari virus Influenza digunakan dalam penelitian ini karena protein M dapat secara spesifik membedakan virus Influenza A dari jenis lainnya. Adapun tujuan khusus dalam penelitian dengan metode eksperimental ini adalah untuk mendapatkan kondisi suhu optimum untuk protein M, dengan atau tanpa penambahan MgCl2. Percobaan deteksi molekuler dilakukan menggunakan MAF 26-MAR 500 dan MAF 306-744 MAR primer, dengan fragmen M sebagai targetnya. Menggunakan RT- PCR, kedua pasangan primer ditentukan pada pengaturan temperatur annealing yang berbeda (54,2°C, 55°C, 56°C, 57,2° C dan 58,2°C). Dilaksanakan pada kondisi yang sesuai, gel elektroforesis menunjukkan pita paling terang pada suhu yang paling cocok. Target band MAF 26-MAR 500 terlihat dalam pengaturan 54,2°C, sama terang dengan sampel pada 55°C, 56°C, 57,2°C dan 58,2°C dan pada primer MAF 306-MAR744 dengan hasil yang menunjukkan pita paling terang di 56°C dengan kondisi buffer mengandung 2mM MgCl2. Hasil ini menunjukkan kondisi optimum yang diperlukan bagi primer diatas untuk dapat digunakan.
Kata kunci: Virus Influenza A, RT-PCR, Protein M.