Skripsi

Molecular diagnosis of H5N1 avian influenza by RT-PCR using H5 primers

Highly Pathogenic Avian Influenza H5N1 has been diagnosed in humans in several countries, including Indonesia. Due to its mutagenic nature, several strains of the same subtype exist. So far RT-PCR has been the best diagnostic tool, however to maintain its sensitivity and specificity, it has to be updated to detect the circulating strain. This study is aimed at trying primers on the H5N1 strain and adjusting to their optimal working conditions. The study is conducted experimentally. Four sets of primers are set to work on c-DNA samples, using buffers of different MgCl2 concentration and different annealing temperatures. All four primers can detect the H5 gene. Primer set H5F449-H5F589 is capable of amplification, however its optimal conditions aren’t clear yet. Primer H5F82-H5R206 best worked at annealing temperature 57.2°C with 2mM MgCl2. Primers H5F539-H5R689 and H5F1013- H5R1169 worked best at 56°C with 2mM MgCl2. Apart from continuous update of primers, further research should also be directed towards multiplex RT-PCR kit for specific diagnosis.




Avian Influenza H5N1 telah didiagnosis pada manusia di beberapa negara, termasuk Indonesia. Karena sifatnya yang mutagenik, muncul beberapa strain dari subtipe yang sama. Sejauh ini RT-PCR merupakan alat diagnosis terbaik, namun untuk mempertahankan sensitifitasnya, perlu pembaharuan yang terus-menerus. Penelitian ini bertujuan untuk menyesuaikan primer yang digunakan untuk RT-PCR dengan virus H5N1 yang beredar dan kondisi reaksinya. Metode penelitian ini berupa eksperimental. Empat set primer ditetapkan untuk bekerja pada sampel c-DNA, menggunakan buffer konsentrasi MgCl2 dan suhu annealing yang berbeda. Keempat primer dapat mendeteksi gen H5. Untuk primer set H5F589-H5F449, kondisi optimal belum dapat dipastikan. Primer H5F82-H5R206 terbaik bekerja pada annealing temperatur 57,2°C dengan 2mM MgCl2. Primer H5F539-H5R689 dan H5F1013-H5R1169 bekerja terbaik di 56°C dengan 2mM MgCl2. Selain terus- menerus memperbarui primer, penelitian lebih lanjut juga harus diarahkan pada pembuatan kit multiplex RT-PCR untuk diagnosis yang lebih specifik.